Bạn có bao giờ tự hỏi làm thế nào để định lượng chính xác số lượng gen trong một mẫu DNA? Hay bạn muốn biết làm thế nào để xác định sự hiện diện của một gen cụ thể trong quá trình nghiên cứu? qPCR (Quantitative Polymerase Chain Reaction) chính là câu trả lời cho những câu hỏi này. Với khả năng định lượng DNA trong thời gian thực, qPCR đã trở thành công cụ quan trọng trong các nghiên cứu khoa học và ứng dụng trong nhiều lĩnh vực như y học, nông nghiệp, và công nghệ sinh học.

Nguyên lý hoạt động

qPCR dựa trên nguyên tắc cơ bản của PCR, nhưng với một cải tiến quan trọng: kết hợp sự mạnh mẽ của PCR với công nghệ phát hiện huỳnh quang, cho phép chúng ta theo dõi quá trình nhân bản DNA trong thời gian thực.

Điều này giúp chúng ta có thể định lượng chính xác lượng DNA mục tiêu ngay từ đầu chu trình PCR, thay vì chỉ xác định sự có mặt hay không của DNA như trong PCR thông thường.

Nguyên lý hoạt động chất huỳnh quang mẫu dò trong qPCR

Trong mỗi chu trình PCR, DNA mẫu được nhân đôi và lượng sản phẩm tăng lên theo cấp số nhân. Khi lượng sản phẩm tăng lên đủ lớn, tín hiệu huỳnh quang phát ra cũng tăng theo. Bằng cách đo cường độ huỳnh quang tại mỗi chu kỳ, chúng ta có thể xác định chính xác chu kỳ mà tín hiệu bắt đầu tăng rõ rệt, gọi là cycle threshold (Ct). Giá trị Ct tỉ lệ nghịch với lượng DNA ban đầu trong mẫu.

Các bước thực hiện qPCR

1.Chuẩn bị mẫu

• Tách chiết DNA hoặc RNA: Tùy thuộc vào mục tiêu nghiên cứu, chúng ta sẽ tách chiết DNA từ tế bào, mô hoặc vi sinh vật, hoặc tách chiết RNA để chuyển đổi thành cDNA.
• Đánh giá chất lượng và nồng độ mẫu: Sử dụng các phương pháp như đo quang phổ UV-Vis hoặc điện di agarose để đảm bảo mẫu đạt chất lượng tốt và nồng độ phù hợp cho phản ứng qPCR.

» Xem thêm: Các phương pháp tách chiết DNA/RNA 

2.Tổng hợp cDNA (nếu cần)

• Enzyme reverse transcriptase: Enzyme này có vai trò quan trọng trong việc tổng hợp mạch cDNA từ mạch khuôn RNA.
• Điều kiện phản ứng: Nhiệt độ, thời gian, nồng độ các thành phần phản ứng.

3.Thiết kế mồi và đầu dò

• Mồi: Các đoạn oligonucleotide ngắn, có trình tự bổ sung với vùng DNA mục tiêu.
• Đầu dò: Các đoạn oligonucleotide gắn huỳnh quang, sử dụng để phát hiện sản phẩm PCR.
• Các phần mềm thiết kế mồi: Primer3, OligoAnalyzer.

4.Pha hỗn hợp phản ứng

• Thành phần: Mẫu DNA/cDNA, mồi, đầu dò, Taq polymerase, dNTPs, dung dịch đệm, MgCl2, thuốc nhuộm huỳnh quang (nếu sử dụng SYBR Green).
• Thể tích phản ứng: Tùy thuộc vào máy qPCR và bộ kit sử dụng.

5.Thực hiện phản ứng

• Máy qPCR: Thiết bị chuyên dụng để thực hiện phản ứng PCR và thu thập dữ liệu huỳnh quang.
• Các giai đoạn nhiệt: Denaturation, annealing, extension.

6.Phân tích dữ liệu

• Phần mềm: Sử dụng các phần mềm chuyên dụng như StepOne Software, QuantStudio Design and Analysis Software.
• Xác định Ct: Chu kỳ mà tín hiệu huỳnh quang vượt quá ngưỡng nhất định.
• Vẽ đường chuẩn: Xây dựng mối quan hệ giữa Ct và nồng độ ban đầu của mẫu.
• So sánh giữa các mẫu: Tính toán độ biểu hiện tương đối của gen mục tiêu.

Đồ thị biểu diễn đường cong nóng chảy của sản phẩm PCR

Đồ thị phân tích cường độ tín hiệu huỳnh quang và đường chuẩn

Ứng dụng của qPCR

1.Y học

• Chẩn đoán bệnh: qPCR được sử dụng để phát hiện và định lượng các mầm bệnh như virus cúm, vi khuẩn kháng thuốc, và đặc biệt là COVID-19.
• Ung thư: qPCR giúp phát hiện sớm các gen ung thư, theo dõi sự xuất hiện của tế bào kháng thuốc.
• Di truyền học: Được ứng dụng để phát hiện đột biến gen và phân tích biểu hiện gen trong các bệnh di truyền.
• Nghiên cứu dược phẩm: qPCR giúp đánh giá hiệu quả của các loại thuốc mới, xác định các biomarker sinh học để dự đoán đáp ứng điều trị của bệnh nhân.

2.Nông nghiệp

• Giống cây trồng: Giúp xác định giống cây trồng, đánh giá độ thuần chủng và phát hiện biến đổi gen.
• Phát hiện mầm bệnh: qPCR giúp phát hiện nhanh chóng các mầm bệnh gây hại cho cây trồng.
• An toàn thực phẩm: Phát hiện sinh vật biến đổi gen (GMO) và kiểm soát chất lượng thực phẩm.

3.Môi trường

• Giám sát ô nhiễm: qPCR được dùng để phát hiện các vi sinh vật gây ô nhiễm môi trường, như vi khuẩn kháng thuốc và virus.
• Đa dạng sinh học: Đánh giá sự đa dạng sinh học của các hệ sinh thái và theo dõi sự biến đổi của quần thể sinh vật.
• Khảo cổ học: qPCR giúp phân tích DNA cổ để nghiên cứu quá trình tiến hóa và di cư của loài người.

4.Công nghệ sinh học

• Phát triển thuốc: qPCR giúp tối ưu hóa quá trình sản xuất protein tái tổ hợp và đánh giá hiệu quả của các vector biểu hiện.
• Tế bào gốc: Nghiên cứu quá trình biệt hóa tế bào gốc và đánh giá phương pháp điều trị tế bào gốc.
• Công nghệ gen: Được sử dụng để kiểm tra hiệu quả của các kỹ thuật chỉnh sửa gen như CRISPR-Cas9.

5.Các ứng dụng khác

• Pháp y: qPCR giúp xác định danh tính cá nhân dựa trên mẫu DNA, phân tích bằng chứng tại hiện trường vụ án.
• Khảo cổ học: qPCR giúp phân tích DNA cổ để nghiên cứu quá trình tiến hóa và di cư của loài người.

Các yếu tố ảnh hưởng đến kết quả qPCR

• Chất lượng mẫu: Độ tinh khiết và nồng độ DNA trong mẫu.
• Thiết kế mồi: Độ đặc hiệu, nhiệt độ annealing.
• Enzyme Taq polymerase: Hoạt tính của enzyme.
• Thuốc nhuộm hoặc đầu dò: Độ nhạy, độ đặc hiệu.
• Điều kiện phản ứng: Nhiệt độ, thời gian, nồng độ các thành phần.
• Ô nhiễm: Ô nhiễm từ môi trường hoặc các mẫu khác.

» Tham khảo thêm: Kiến thức chi tiết về kỹ thuật Real-time PCR (qPCR)

Kết luận

qPCR là công cụ mạnh mẽ trong nghiên cứu sinh học phân tử, cho phép định lượng DNA trong thời gian thực với độ chính xác và độ nhạy cao. Nó không chỉ quan trọng trong nghiên cứu y học, di truyền học, mà còn có nhiều ứng dụng trong nông nghiệp, môi trường và công nghệ sinh học. Hiểu rõ nguyên lý hoạt động và ứng dụng của qPCR sẽ giúp các nhà nghiên cứu đạt được kết quả chính xác, mở rộng tiềm năng trong các lĩnh vực nghiên cứu và ứng dụng khác nhau.

Về chúng tôi

Viettrungsci là công ty chuyên cung cấp các thiết bị khoa học chất lượng cao, bao gồm máy PCR, máy qPCR, và nhiều thiết bị nghiên cứu khác. Chúng tôi cam kết mang đến sản phẩm chính hãng, dịch vụ tư vấn và hỗ trợ kỹ thuật chuyên nghiệp, giúp nâng cao hiệu quả nghiên cứu và ứng dụng của bạn.

CÔNG TY CỔ PHẦN KHOA HỌC CÔNG NGHỆ VIỆT TRUNG

• Hotline: 0868 032 089
• Mail: sales@viettrungsci.com.vn
• Facebook: Thiết bị khoa học Việt Trung